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中国动物疾病模型重大进展:首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪诞生

时间:2018-04-03 16:54 分类:动物世界 作者:记录片天堂(www.jiluniwo.cn)

最新的进展是,该疾病的大动物模型成功建立。北京时间3月30日,生物学顶级学术期刊《细胞》(Cell)在线发表了中国科学家的一项重大成果:首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术(SCNT),成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪,精准地模拟出人类神经退行性疾病。2个月以前,中国科学家获得全球首个体细胞克隆猴的成果也发表在该期刊。
赖良学强调,“以前用转基因技术将外源基因转进去之后,猪本身的亨廷顿蛋白也在同时起作用,这次通过基因编辑敲入,猪本身基因是破坏掉的。这样,猪本身的亨廷顿基因就不会表达了,纯粹表达人致病基因。结果出来的症状、病理变化都是跟自然发生的是一致的。”

研究结果显示,F1代在基因表达、体重增加、早期死亡、运动困难、呼吸困难等方面都和F0代类似。这意味着,发生在亨廷顿病患者身上的“遗传性”在基因敲入猪模型上也同样实现。
论文共同通讯作者为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、美国埃默里大学李世华教授。李晓江是亨廷顿病研究领域的权威,于2008年和李世华在世界上首次利用转基因的方法建立了非人灵长类的亨廷顿疾病猴模型。赖良学则长期从事猪等大型哺乳动物的克隆,2010年和李晓江、李世华合作建立了首例转基因亨廷顿舞蹈病的猪模型。

赖良学认为,这或许是造成个体之间发病时间不一样、发病轻重也不一样的原因。

值得一提的是,此前研究团队用转基因试图建立的猴模型、猪模型,皆因表达外源性致病基因片段的毒性过强,出生不久后即死亡。而研究团队此番成果的重要性之一就在于实现了传代。

亨廷顿病的病因是,患者体内的亨廷顿基因外显子1发生了CAG三核苷酸重复突变,进而引发其编码的亨廷顿蛋白(HTT)多聚谷氨酰胺(polyQ)序列延长所致。实际上,除亨廷顿病之外,多聚谷氨酰胺序列延长还会导致其他至少8种神经退行性疾病,包括脊髓小脑共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症(肯尼迪病)等。

值得一提的是,该项研究之所以被视为神经退行性疾病研究领域中的一个里程碑式的发现,关键一点还在于此前经常使用的模型为小鼠等啮齿类动物,而种间差异实际上是一道很大的研究鸿沟。
论文中指出,尽管亨廷顿症小鼠模型在突变亨廷顿蛋白方面表现出和年龄相关的累积,以及其他一些神经学症状,但基因敲入亨廷顿小鼠缺乏明显的神经退行性,而这正是亨廷顿病经典的病理学标记。

中国动物疾病模型重大进展:首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪诞生

代代相传、多因素决定能活多久

1872年,亨廷顿病由美国医学家乔治•亨廷顿首次发现并因此命名。患病者会表现出手舞足蹈状,故又被称为“致命的舞蹈”。

中国动物疾病模型重大进展:首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪诞生

研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将人突变的亨廷顿基因,即人外显子1中包含150 CAG重复序列精确地插入猪的亨廷顿蛋白内源性基因中。研究团队通过PCR筛选了2430个融水胎儿猪成纤维细胞,最终确定了9个阳性克隆细胞。

赖良学表示,“和人一样,这些猪也可以发育到性成熟(猪性成熟在5-6个月),可以有后代。2010年我们发过的文章是用转基因猪,它的症状就太明显了,表达量太高,所以生下来几天就死了。李晓江教授在美国用的转基因猴也一样,也没活下去。没活下来就没有用,并没有形成这个动物模型。”
值得一提的是,这头5个月大的基因敲入猪在跑步机测试2天后即死亡了。研究团队认为,这一点或许说明基因敲入猪难以承受运动负荷,呼吸衰竭可能是这头猪死亡的直接原因。
而肺功能障碍和吸入性肺炎或窒息也可能是亨廷顿患者的主要死因。
不过有趣的是,基因型分析显示,CAG重复并不稳定。实验结果得出,在F0代中是130-150 CAGs,F1代是113-206 CAGs,F2代是118-230 CAGs。另外,在不同组织中CAG重复也是不一致的。

除症状之外,这些基因敲入猪的大脑区域选择性神经病理学也和人类相似。病理学分析显示,5个月大基因敲入猪大脑尺寸比同龄的野生型猪要小,大脑皮层的厚度和纹状体的尺寸也更小。对5个月大的已有症状的基因敲入猪进行MRI(核磁共振成像)分析也显示出,它们的侧脑室扩大、纹状体尺寸则减小。

赖良学提到,“除非采用基因检测,否则很难在没有发病前意识到自己患病。”

亨廷顿病主要特点是躯体和四肢不可控制地舞蹈样运动,渐进性认知能力下降和精神障碍,主要病理特征则为大脑纹状体区中型棘突神经元(MSN)逐渐丢失。

赖良学在接受湃新闻()采访时表示,“过去长期存在的问题是,我们用转基因克隆技术试图建立亨廷顿病的大动物模型,但转基因的缺点是基因插入位置无法控制、表达量也无法控制,因此此前转基因克隆获得的猪或者猴子都存活不了几天,准确来说无法称之为模型。”

研究也确实发现,对F1代的基因敲除猪采用“单间”饲养,也就是帮助它们减少环境压力后,它们的寿命比F0代这些“群体”饲养的基因敲除猪要长。

著名的细胞生物学家、原同济大学校长、中科院院士裴钢表示,2008年,我们在制定发育与生殖研究国家重大科学研究计划"十二五"专项规划时,就前瞻性地布局了大型实验动物模型包括猪和猴的培育内容,并在后来的“干细胞国家重大科学研究计划”中持续加大经费投入。
症状、病理与人类似

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